當奈米顆粒追蹤成像技術中加入 AI 技術，會取得怎樣的顯著進步呢？
近期，廈門大學方寧教授團隊基於深度學習研發了一種自動化、高速、多維的單粒子追蹤（single particle tracking，SPT）系統，打破了細胞微環境中奈米顆粒旋轉追蹤的局限性。
透過深度學習能夠學習、提取復雜影像和序列數據中的特征，從而實作在奈米尺度下，全方位、精準追蹤活細胞內單分子/單個奈米顆粒。 不僅追蹤了在三維空間的位移，還首次觀測到分子/奈米顆粒的旋轉運動。
需要了解的是，在生物醫學領域，透過控制奈米顆粒的旋轉運動，能夠實作對細胞和生物分子的操控和檢測。實際上，奈米顆粒的旋轉運動與諸多重要的生物過程密切相關，例如在生物傳感器中作為探針，用於奈米藥物傳遞以及解析進入細胞的機制等。
圖丨方寧（來源：方寧）
該方法在成像研究中具有廣泛的套用，例如探究復雜環境中探針的旋轉和平移等行為。 在樣品制備完成條件下，可實作從儀器數據處理到解析的自動化流程，為未來實作完整的自動化藥物遞送全流程奠定基礎，並為高速篩選藥物的遞送研究和制藥生產線提供全新的方案。
審稿人對該研究評價稱：「作者介紹了一種自動化、高速、多維的 SPT 系統，用於追蹤活細胞內各向異性金奈米探針的三維取向。特別是，他們詳細解釋了訓練摺積神經網路（Convolutional Neural Network，CNN）的數據集構建和預處理方法。透過這種方式，展示了訓練有效模型的能力。」
近日，相關論文以【深度學習輔助的活細胞自動多維單粒子追蹤】（Deep Learning-Assisted Automated Multidimensional Single Particle Tracking in Living Cells）為題發表在 Nano Letters[1]。
廈門大學博士研究生宋東良、張欣為共同第一作者，廈門大學方寧教授、溫州醫科大學程曉東博士和美國百時美施貴寶公司高級研究員李界明擔任共同通訊作者。
圖丨相關論文（來源：Nano Letters）
同時追蹤活細胞八個維度資訊
傳統的單顆粒追蹤方法通常僅能處理二維平面或時間序列數據。在常規的實驗條件下，由於奈米顆粒尺寸極小，在細胞環境或組織環境中訊號比較弱，無法看到它的旋轉運動過程。並且，用理論解析得到的相關訊號不僅效率低，而且很容易存在人為誤差。
方寧指出，「如果我們能夠即時探測到探針受到限制過程的變化趨勢，就可以知道它具體受到了怎樣的限制。」
為解決上述問題，該課題組開發了一種與深度學習演算法整合的自動化、高速、多維 SPT 系統，用於以高定位精度（<10nm）和時間分辨率（最快 0.9ms），來跟蹤活細胞中各向異性金奈米粒子探針的 3D 取向，克服了在低訊雜比條件下旋轉跟蹤的局限性。
圖丨整體思路示意圖（來源：Nano Letters）
該課題組將 AI 引入到復雜的實驗中，來幫助和替代以往人工幹預以及人工判斷的過程，對復雜細胞環境的運動過程自動辨識和分類，追蹤目標探針和直接解析藥物遞送顆粒的機制。
在 SPT 實驗中，透過揭示各向異性光學奈米探針的平移和旋轉動力學，能夠提供細胞活動的分子水平資訊。
該方法可以在 S/N 約為 4 的情況下，在實驗和模擬數據上求解方位角（0°-360°）和極角（0°-90°），誤差小於 2°。即使當 S/N 接近 1 的極限時，該方法仍然比傳統的模式匹配方法保持更好的魯棒性和抗雜訊性。
（來源：Nano Letters）
值得關註的是，在該研究中，研究人員實作了包括空間、時間和熒光強度等在內的多維度成像。方寧指出，「 這個實驗是迄今為止最復雜的細胞成像實驗，我們實作了八個維度的同時成像。 」
透過對活細胞內沿微管運輸的藥物遞送過程展開實驗，證明了多維 SPT 系統的有效性。該研究涉及大量的學科交叉，包括光學成像、硬體搭建、AI 演算法設計、程式數據分析等。「在該研究中，宋東良同學做了大量的工作，並將各學科融會貫通。」方寧表示。
向單分子診療、藥物遞送及精準醫療等方向推進發展
據介紹，該團隊對於將 AI 引入實驗劃分為三個階段，分別是對影像的自動辨識、運動模式及細胞行為的分類以及預測。
在該研究中已經完成了第一階段，也就是基於計算模擬生成的數據對影像自動辨識。目前，他們即將完成第二階段，即對細胞過程進行追蹤並依據運動模式分類。
方寧舉例說道：「比如在細胞裏奈米藥物遞送穿過細胞膜，被傳輸到最終的目標位置，釋放過程會經歷不同的階段。因此它的分子行為也不同，該階段以能夠自動辨識細胞的分類運動情況為目標。」
在第二階段中，除了影像辨識，還需要大量的資訊判定，因此需要深度學習將細胞中的整個生物過程作為訓練集。據介紹，目前該課題組正在使用實驗室過去十幾年的數據進行訓練。
圖丨多維成像系統及深度學習影像辨識演算法（來源： Nano Letters）
第三階段是運動模式分類的基礎上，對藥物遞送的行程與結果進行預測。方寧表示：「在透過各種顯微鏡或電鏡等獲得海量數據後，我們可以透過 AI 分析大規模數據集和活細胞的即時動態，這對制藥行業來說非常有意義。」
目前，雖然國內已有很多分子診斷的相關套用，但用成像技術進行單分子追蹤仍然處於空白的階段。
而在國外，單分子醫學診療領域已經有公司進入商業化階段。2022 年，美國單分子追蹤公司 Eikon Therapeutics 獲得超過 5 億美元的融資。
在現階段，這項技術的直接產品是科學儀器，此前研究人員已申請相關國際專利。據悉，未來該團隊計劃將結合更多藥廠的藥物遞送體系相關數據，以包含藥物效果評判的過程和全流程。
從科學儀器的角度來看，這種儀器方法已經在單分子/單顆粒成像領域產生一些比較顯著的影響。「我希望該技術不是僅停留在實驗室，而是推動向新型單分子診療、奈米藥物遞送以及精準醫療等方向發展，目前我們也在推進相關合作。」 方寧表示。
「歷盡千帆，歸來仍是少年」
方寧本科畢業於廈門大學，在加拿大英屬哥倫比亞大學獲得博士學位後，於美國能源部埃姆斯國家實驗室及愛荷華州立大學從事博士後研究。之後，他分別在美國愛荷華州立大學擔任助理教授和美國喬治亞州立大學擔任教授。
2021 年，方寧作為特聘教授和祥華講座教授全職加入母校廈門大學，目前團隊成員 30 余人，以生物和化學光學成像為重點研究方向，包括：光學成像儀器開發和套用、單顆粒旋轉追蹤技術和單分子化學成像等。
談及回國任職，方寧感慨道：「雖然在美國各方面科研條件都不錯，但我認為在 45 歲之前回到祖國是一個黃金契機，還有很多時間去做更多事情。回到我的母校廈大，對我來說是一種榮譽。」
圖丨方寧課題組（來源：方寧）
此前，方寧帶領課題組針對難以在活細胞中測量關鍵生物分子構象轉化動態過程的問題，首次在實驗上解決了領域內的爭議。他們開發全新的單粒子旋轉追蹤系統，率先在活細胞中觀察囊泡沿著縊斷蛋白螺旋手性方向的定向旋轉，在闡明受體介導內吞機制方面取得突破性進展[2]。
德國國家科學院院士、法國巴黎居禮研究所盧德格爾·約翰尼斯（Ludger Johannes）教授在 Nature Cell Biology 對上述研究評論道：「這種方法代表了技術上的傑作，」並特別指出，「除了對了解細胞背景中縊斷蛋白功能的分子機制做出貢獻外，目前的研究更普遍地強調了角度敏感顯微鏡技術的力量，以及這些技術可能在膜生物學領域做出的更大貢獻[3]。」
（來源：Nature Cell Biology ）
為了動態監控蛋白時空分布與蛋白間交互作用，該團隊開發可自動三維聚焦、高空間和角度分辨率的單粒子追蹤技術，透過理論推導半平面點擴散函式仿真模擬與角度相關的單粒子離焦圖案來解析三維角度，即時解析囊泡在細胞中運輸的旋轉動力學，發現馬達蛋白-囊泡-細胞微管交互作用的新模式[4]。
美國科學院院士、美國賓夕法尼亞大學耶爾·E·高德曼（Yale E. Goldman）教授在 Biophysical Journal 特別指出：「這種智慧的光學和分析方法可直接套用於其他細胞內物質，或由其他實驗室用以高分辨率空間角度成像。未來這類研究有望揭示分子馬達活動和細胞內貨物的靶向運輸之間令人困惑的關系[5]。」
程曉東表示，這次的新研究是使用深度學習/AI 輔助成像對活細胞生命過程研究的第一步。未來希望在 AI 的幫助下，能夠使用多維成像技術實作對蛋白功能和細胞行為的解析和預測。
與「開著一輛擁有自動駕駛感知能力的汽車」類似，「當該探針在細胞中運動時，可以根據它的行為分析和判斷周圍環境，並對下一步的可能性進行預測。」他說。
方寧認為，在 AI 技術的加持下，該方法將推動實驗和儀器的進一步的發展。「原來只有科研實驗室才能夠用得起、用得上。未來我們會將技術商業化，並拓展到制藥領域。」
參考資料：
1.Song,D. et al. Deep Learning-Assisted Automated Multidimensional Single Particle Tracking in Living Cells. Nano Letters (2024). https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c04870
2.Dynamin-dependent vesicle twist at the final stage of clathrin-mediated endocytosis.
Nature Cell Biology
23, 859–869 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00713-x
3.Johannes, L., Valades-Cruz, C.A. The final twist in endocytic membrane scission.
Nature Cell Biology
23, 812–813 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00711-z
4.Resolving cargo-motor-track interactions with bifocal parallax single-particle tracking. Biophysical Journal 120(8), 1378-1386 (2021). （https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.11.2278
5.Yale E. Goldman. Biophysical Journal 2021, 120, 1306. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.02.026
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