原创 Sirius 图灵基因 今天
收录于话题 前沿分子生物学机制
撰文：Sirius
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亮点
研究者证明了SARS-CoV-2进化过程中，S蛋白出现D614G的替换会导致SARS-CoV-2与人类宿主细胞表面受体ACE2的结合，增加了病毒再体内的结合和复制，为S-614G变异体在目前流行的SARS-CoV-2病毒中占据全球主导地位提供了解释。
2021年02月26日由包括美国疾病控制中心在内的多个机构，周斌和Martin Beer等在【Nature】杂志上发表了一篇名为「
SARS-CoV-2 spike D614G change enhances replication and transmission
」的研究文章，在这里，研究人员利用等基因的SARS-CoV-2变异体，证明了S-614G变异体增强了与人类宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合，并增加了病毒在原代人支气管和鼻气道上皮细胞培养物以及一种新的人ACE2敲入小鼠模型中的复制，以及显著增加了SARS-CoV-2感染的仓鼠和雪貂模型中的复制和传播性，为S-614G变异在目前流行的SARS-CoV-2病毒中占据全球主导地位提供了解释。
2019年末，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)在中国湖北省武汉市出现，并迅速发展成为新冠肺炎大流行。到2020年12月，在全球已确认7000万例和150万例死亡病例。SARS-CoV-2进入细胞依赖于spike糖蛋白(S蛋白)与ACE2的相互作用。S蛋白是一个同源三聚体I类融合蛋白，由两个亚基S1和S2组成，由一个蛋白酶切割位点隔开。S1形成一个球形头部，是受体结合所必需的，而S2则介导病毒被膜与宿主细胞膜的融合。在进入细胞过程中，S1亚基内的受体结合域(RBD)与ACE2结合，在S2亚基中产生构象变化，促进病毒内化。。S-D614G是一种含有RBD外S蛋白替代的蛋白质变体，被认为会引起构象变化，改善ACE2的结合，增加感染的可能性。
随着疫情的发展，SARS-CoV-2S-614G变种在频率上迅速取代亲本S-614D变种，成为全球主导。本文章研究者主要想要阐明S-D614G替代在新冠肺炎大流行期间这种SARS-CoV-2变异株的传播和优势中所起的作用，研究了S蛋白与人ACE2的结合(HACE2)和体外复制动力学，并使用三种不同的动物模型评估了体内感染和传播动力学。
SARS-CoV-2 S-614G可以更有效地与hACE2结合，用生物层干涉法定量了S1结构域单体与hACE2的结合。含有614D或614G的S1蛋白(分别为S1-614D和S1-614G)都能有效地与hACE2结合；然而，S1-614G的亲和力比S1-614D高约2倍(图1a)，S-D614G替换还导致S1与婴儿仓鼠肾脏细胞(BHK-hACE2)外源表达的hACE2结合增强(图1b)。随后进一步发现SARS-CoV-2S-614G病毒在原代人上皮细胞中的复制增强，研究者使用SARS-CoV-2反向遗传学系统产生了一个等基因的D614G病毒对。SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G在Vero E6细胞中的复制动力学略有不同(图1c)。评估了病毒在原代人鼻上皮(HNE)和原代正常人支气管上皮(NhBE)在气液界面条件下的复制动力学，这种条件类似于人类呼吸道上皮的假复层上皮衬里。在33 °C鼻腔上皮温度下，感染SARS-CoV-2S-614D或SARS-CoV-2S-614G后的原代HNE细胞无明显差异(图1c)。相反，SARS-CoV-2S-614G在33 °C、37 °C和39 °C（分别模拟上呼吸道、下呼吸道或发烧的温度）的原代NhBE细胞中显示出较高的滴度 (图1D)。竞争试验的结果表明在两种原代人类呼吸道培养系统中，614G：614D的比例在感染的5天或8天内向SARS-CoV-2S-614G转移(图1e，f)。S蛋白D614G的改变与SARS-CoV-2感染的原代人类气道上皮模型中hACE2结合增强和复制增加有关。
为了评估SARS-CoV-2S-614G变体在体内的相对适合性，培育了在ACE2基因的内源调控元件下表达hACE2的敲入小鼠。在两种病毒(SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G)的等量混合的竞争实验中，通过汇集每个变种的1x105空斑形成单位(PFU)(图2a)。实时定量PCR检测口咽拭子(每日)和不同组织(接种P.I后第2天和第4天)的病毒RNA载量。口咽拭子的纵向分析显示，与野生型小鼠相比，hACE2-Ki小鼠在上呼吸道的病毒复制有效(图2b)。口咽拭子的NGS显示，在大多数动物和时间点，SARS-CoV-2S-614G比SARS-CoV-2S-614D具有净优势(图2c)，在器官方面，发现SARS-CoV-2S-614G具有类似的复制优势(图2d)。总的来说，这些结果证明SARS-CoV-2S-614G在表达真实人类受体(HACE2)的小鼠模型中复制增加。
研究了S-614变异株在仓鼠模型中的复制动力学。仓鼠对SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G的感染高度易感，发生的疾病与人类的泛呼吸道、中、重度新冠肺炎病非常相似。以SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G混合毒株1：1(以传染性PFU滴度为基础)鼻腔接种6只供体叙利亚仓鼠进行直接「一对一」传播试验。随后使用NGS和带有等位基因特异性锁定核酸(LNA)探针的数字液滴PCR绝对定量来确认接种体内两个变异体的RNA比率(图3)。鼻洗液病毒RNA序列组成的NGS显示在接种后48小时内显著向SARS-CoV-2S-614G转移(图3)，传播率为100%，序列组成分析表明，等比例接种后SARS-CoV-2S-614G变异株占比大于90%。
进一步研究了D614G在雪貂中的竞争优势，雪貂的竞争实验表明（图4），SARS-CoV-2S-614G变种优先感染和复制了6只接种动物中的5只，传播事件完全通过SARS-CoV-2S-614G变种成功。
总而言之，研究人员通过开发各种SARS-CoV-2体外和体内感染模型来扩展具有D614G取代的S1或单体S胞外结构域的SARS-CoV-2病毒的研究，包括原代NhBE和HNE培养，一种新的hACE2敲入小鼠模型，一种仓鼠模型，以及一种雪貂模型。D614G变异提供的优势在仓鼠和雪貂的竞争和传播实验中变得最为突出，因此必须被视为导致SARS-CoV-2614G变异株在全球占据主导地位的驱动力。
作者介绍
Bin Zhou
博士，本文第一作者，本科毕业于南京大学，博士就读于纽约州立大学奥尔巴尼分校病毒学，目前就职于美国疾病预防与控制中心，担任流感司病毒学监测和诊断处疫苗准备小组组长。
参考文献
1、Zhou, B., Thi Nhu Thao, T., Hoffmann, D. et al. SARS-CoV-2 spike D614Gchange enhances replication and transmission. Nature (2021).https://
doi.org/10.1038/s41586-
021-03361-1
