關註公眾號【博溪檢測】，回復關鍵詞「精準測評，從芯啟航」獲取11月20日博溪釋出會PPT~
以下為博溪檢測類器官與評價科學研究院陸星博士的報告實錄：
各位領導、各位來賓，大家下午好。今天我將與大家分享【微流控細胞與器官芯片在美白祛斑功效方向的測評套用】，以美白祛斑功效為例向大家介紹芯片具體的測評套用。
從古至今，美與白是我們不變的追求。隨著朝代更叠，從追求膚若凝脂，到面如白玉，再到人面桃花，人們對白的追求與審美不僅僅停留在表觀，更是由內而外的健康白。美白的方式也實作了從外遮到內調，從刺激到安全的進階。如今，我們已能從更加科學的角度、更加高效的方式來認識美白、研究美白。
PART 01 皮膚的美白機制是復雜的，我們需要關註更整合的通路
那究竟是什麽決定了人的膚色呢？皮膚從結構上分為表皮層和真皮層，而影響膚色的黑素細胞位於表皮的基底處。黑素小體是黑素細胞內獨特的胞器，負責黑色素的生物合成、儲存和運輸。有研究表明，世界上三大主要人種中，黑種人皮膚中黑素小體占比高達89%，白種人僅有15%。高度色沈的皮膚比淺度色沈的皮膚中的黑素小體高出5倍，這也是導致不同人種膚色不同的主要原因。另外，我們的皮膚在經過太陽光暴曬後，黑素細胞會分泌更多黑素小體及黑色素，使表觀皮膚呈現不同顏色。因此， 黑素細胞及黑素小體的合成效率決定了不同種族以及不同狀態的膚色差異。
再具體來說，在黑素細胞內，酪胺酸經過酪胺酸酶的催化、氧化等一系列步驟，最終會合成真黑素和褐黑素，其中真黑素與皮膚色沈直接相關。每一個黑素細胞周圍，大約有36個角質形成細胞，黑素細胞透過樹突向角質形成細胞輸送黑素小體，黑素小體會在角質形成細胞核上形成核上帽，對角質形成細胞提供光保護。 所以，黑素小體及黑色素在表皮層中的分布和含量決定了不同膚色。
現階段我們常用的美白祛斑功效驗證方法主要有以下五種，涵蓋了蛋白和分子層面：酪胺酸酶的活性檢測（包括與黑素合成相關基因的檢測）、黑素含量檢測、黑素細胞銀染、黑素合成相關蛋白檢測、以及包含角質形成細胞的黑素轉運能力檢測。
黑素合成、轉運、分布機制是復雜的，因此我們可以找到很多方法抑制黑素合成，達到美白功效。比如，從源頭抑制黑素合成、在過程中抑制黑素轉運、甚至從結果上促進黑素代謝與自噬。但是， 在目前的檢測方法中，80%都集中在抑制黑素細胞內的酪胺酸酶活性，忽略了同樣有重要影響的黑素轉運和代謝過程。
PART 02 現有方法難以實作美白活性物的篩選，原料創新陷入瓶頸
現階段，對比緊致功效方向的原料，行業內美白原料類別偏少——在註冊備案並廣泛使用的原料中，菸鹼醯胺和間苯二酚占據了較高比例。將現有的美白原料進行多靶點、多機制的組合以達到1+1>2的協同增效作用，是現在美白產品常用手段之一。
反觀消費者對美白產品的需求，越來越趨於場景化，常見的諸如日照、炎癥、衰老等。使用光敏性原料的化妝品、攝入光毒性藥物，也會導致皮膚色素的沈著。復雜的場景下，加上消費者意識的提升，不同膚質的消費者對美白產品的開發提出了更為精細化的要求。
PART 03 精準美白需要對不同場景下的色沈及美白機制進行更深入的研究
光照是常見的皮膚色沈場景，像紫外、藍光，誘導色沈的機制都是不同的。 紫外光主要會使細胞內DNA受到氧化應激損傷，從而啟用下遊基因，誘導黑素合成相關蛋白的高表達。可見光（如手機、電腦發出的藍光）主要透過視蛋白3介導引起下遊蛋白依次磷酸化，導致黑素合成上調。光照條件下，角質形成細胞和成纖維細胞也會分泌不同的細胞因子來調節黑素細胞功能，促進或者減少細胞氧化應激損傷，來調節黑素合成。
過度光老化會導致細胞衰老，這又是另一個會導致色素沈著的常見場景， 如老年斑、黃褐斑的形成。細胞老化導致的色素沈著不僅僅局限於黑素細胞，還會和其臨近的皮膚細胞交互作用，如角質形成細胞、成纖維細胞及內皮細胞的衰老，共同參與皮膚色素陳追穩態的調節。同時，衰老細胞會分泌多種炎癥因子、生長因子、蛋白酶等（衰老細胞分泌表型，SASP），誘導靶細胞衰老及組織微環境改變，進一步導致皮膚色沈。
另外，有研究表明，免疫細胞的衰老也會參與皮膚色沈， 導致炎癥色沈。炎癥色沈是指皮膚在受到刺激或炎癥後出現的皮膚色沈現象。當表皮受到炎癥刺激，角質形成細胞會分泌促炎因子，刺激黑素細胞生成更多黑色素，或透過旁分泌的反饋路徑，刺激真皮層成纖維細胞釋放黑素細胞刺激因子，從而調節黑素合成。
其實， 皮膚色素沈著不僅僅與黑素細胞有關，還與角質形成細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、內皮細胞等多種細胞的作用密不可分。而成纖維細胞、黑素細胞及角質形成細胞形成的FMK互作體系，在色素沈著中發揮至關重要的作用 。
PART 04 針對復雜美白機制的模型應滿足高通量、高重復性、更高效、更準確的設計要求
我們結合微流控細胞芯片，以黑素細胞為核心，加入成纖維細胞、角質形成層細胞，用3D培養、流體力學方法共培養，構建新型美白測評功效模型。該模型有兩個特點：
特性一：支持更復雜細胞構成類器官模型，可構建單一黑素細胞模型或三種及以上黑素細胞全層皮膚類器官模型。 透過細胞的染色定位，可以觀察到在自組裝情況下類器官顯示出一定極性，結構與真實皮膚類似，成纖維細胞居於外側，角質形成層細胞居於內側，黑素細胞均勻分散。
特性二：相對於微孔板體系，展現出更強的細胞自組裝能力。 在微孔板中，黑素細胞沈落到底部過程中很容易聚團，很難與其他細胞均勻接觸，自組裝成類器官。而微流控芯片由於獨特的結構設計，黑素細胞可以迅速沈落到坑底，與其他細胞接觸互作，均勻分布，形成自組裝類器官。
基於以上特性，我們建立了美白祛斑功效的測評體系。 首先向芯片內灌註一定濃度和比例的細胞，使其自組裝成類器官，然後加入不同濃度的待測化合物，進行孵育，即可在鏡下拍照、染色、檢測等相關測試。
利用該模型，我們也進行了多種美白原料的功效測試。圖中展示了明場環境的照片，可以看到從Day1到Day3，黑素全層皮膚類器官模型表觀色度逐漸變黑，表明黑素細胞的正常合成及轉運分布。我們選取了四種常見的美白原料，分別為曲酸、光甘草定、熊果苷和菸鹼醯胺。在成纖維細胞、黑素細胞和角質形成細胞交互作用的體系下，這四種美白原料均展現出了較好的美白效果。
局部放大芯片，還可以更為細致地觀察黑素全層皮膚類器官細胞球色度及直徑、黑色素分布情況。
另外，我們針對黑素全層皮膚類器官開發了一套演算法。基於這些演算法，我們對化妝品原料進行了實分時析，每組至少選擇了24個細胞球，可以看到這四種化合物都能顯著降低細胞球色度。
與傳統方法相比，黑素全層皮膚類器官芯片能夠更加真實反映化合物的功效 。菸鹼醯胺在人體上展現出非常好的美白效果，一方面是它可以透過抑制黑素小體從黑素細胞轉運到角質形成細胞，另一方面它能夠抑制黑素的合成，並具有一定的抗氧化和抗炎作用。但是在單一的黑素細胞及黑素細胞與角質形成細胞共培養體系中，並未發現菸鹼醯胺有很好的效果，而黑素全層皮膚類器官在三種細胞交互作用及流體力學支持下，能很好地模擬真實微生理環境，從而使菸鹼醯胺展現出更接近在人體上真實使用時的功效。
除了表觀色度，
我們還進一步分析了細胞球內特異性蛋白的表達
。gp100是黑素小體中的特異性蛋白。透過免疫熒光染色，我們觀察到四種化合物都使其表達含量下降，說明它們均可抑制黑素小體的生成。
黑素全層皮膚類器官芯片包含三種細胞，因此，我們還可以進行兩種或兩種以上蛋白質的復染，來研究黑素轉運的機制。我們復染了gp100蛋白及角質形成細胞內泛角蛋白，可以看到菸鹼醯胺不僅可以降低黑素小體合成，還能抑制其向角質形成細胞轉運。 微流控皮膚類器官芯片可在原位快速實作多蛋白的表達分析 ，1~2天即可完成實驗。
目前，黑色素定量分析公認的方法是將細胞裂解，再提取黑色素檢測吸光度。相比這種破壞性測試方法，我們開發了非侵入性的方法——拉曼光譜，來進行黑色素的量化分析。以菸鹼醯胺樣品進行了拉曼光譜檢測，我們可以得到三個座標軸訊號強度的變化（紅色代表訊號強度高，即黑色素含量高；藍色代表訊號強度低，即黑色素含量低），圖中可看到菸鹼醯胺能夠明顯降低細胞球內黑色素含量。
此外，我們還進行了主成分分析，可得到菸鹼醯胺處理組和空白對照組有明顯差異，說明菸鹼醯胺不僅降低了黑色素的含量，還可能改變了細胞內的其他成分。
拉曼圖譜不僅可以辨識黑色素含量變化，還可以檢測蛋白質、脂質等多個成分指標。
以上都是我們對多樣品的功效測試，而 皮膚類器官芯片還可以結合濃度梯度發生器芯片進行單個樣品的多濃度功效測試 。我們也以菸鹼醯胺為例進行了不同濃度的測試，從結果上看，不同濃度菸鹼醯胺有不同程度的美白效果，高濃度時展現出很好的美白效果。
相比於傳統先進行細胞毒性檢測篩選出安全濃度，再進行功效檢測，使用 皮膚類器官芯片加濃度梯度發生器芯片，可以實作樣品安全性及功效性的同步快速篩查，還可以進行多樣品原料的快速復配，實作種類、比例、濃度的篩選 。圖中也可以看到最高濃度的菸鹼醯胺對細胞球產生了一定毒性，使其略微分散。
透過以上的案例，我們可以看到皮膚類器官芯片具有諸多優勢，
如更少的細胞使用量及更快的細胞成球時間、更好的細胞均一程度等
。流體力學的加持，不僅支持全換液模式，還增強了藥物敏感性。黑素全層皮膚類器官模型，相比於傳統的2D細胞和3D重組皮膚類器官模型，
能夠在多種細胞互作的情況下更加高效、準確地對美白原料進行功效測試，不僅適用於活性物或活性物復配的盲篩，也可以靈活改變組成細胞種類、添加不同細胞因子及趨化因子，未來還可增加力學機械條件，以模擬和適配更多場景。
PART 05 微流控類器官芯片未來在美白祛斑功效研究方面的作用
微流控類器官芯片構建的皮膚類器官模型實作了多項突破， 能夠更加真實地模擬人體生理結構，實作更高效、更精確的美白祛斑成分測試，提高美白產品的研發效率和安全性，推動個人化美白產品的開發，加快新產品上市速度 。下一步，我們將繼續探索更加多樣化的類器官模型構建，以適配更加細分的場景。同時，透過 超分辨顯微鏡進行類器官自組裝過程及細胞定位變化的時空監測，也能動態監測藥物作用過程中黑素變化過程 。
相信隨著技術的不斷推進以及場景的不斷拓展中，微流控類器官芯片在美白祛斑功效上能夠發揮越來越重要的作用。
感謝大家！
