原創 Sirius 圖靈基因 今天
收錄於話題 前沿分子生物學機制
撰文：Sirius
IF=42.778
推薦度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮點
研究者證明了SARS-CoV-2前進演化過程中，S蛋白出現D614G的替換會導致SARS-CoV-2與人類宿主細胞表面受體ACE2的結合，增加了病毒再體內的結合和復制，為S-614G變異體在目前流行的SARS-CoV-2病毒中占據全球主導地位提供了解釋。
2021年02月26日由包括美國疾病控制中心在內的多個機構，周斌和Martin Beer等在【Nature】雜誌上發表了一篇名為「
SARS-CoV-2 spike D614G change enhances replication and transmission
」的研究文章，在這裏，研究人員利用等基因的SARS-CoV-2變異體，證明了S-614G變異體增強了與人類宿主細胞表面受體血管收縮素轉換酶2(ACE2)的結合，並增加了病毒在原代人支氣管和鼻氣道上皮細胞培養物以及一種新的人ACE2敲入小鼠模型中的復制，以及顯著增加了SARS-CoV-2感染的倉鼠和雪貂模型中的復制和傳播性，為S-614G變異在目前流行的SARS-CoV-2病毒中占據全球主導地位提供了解釋。
2019年末，嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)在中國湖北省武漢市出現，並迅速發展成為新冠肺炎大流行。到2020年12月，在全球已確認7000萬例和150萬例死亡病例。SARS-CoV-2進入細胞依賴於spike糖蛋白(S蛋白)與ACE2的交互作用。S蛋白是一個同源三聚體I類融合蛋白，由兩個亞基S1和S2組成，由一個蛋白酶切割位點隔開。S1形成一個球形頭部，是受體結合所必需的，而S2則介導病毒被膜與宿主細胞膜的融合。在進入細胞過程中，S1亞基內的受體結合域(RBD)與ACE2結合，在S2亞基中產生構象變化，促進病毒內化。。S-D614G是一種含有RBD外S蛋白替代的蛋白質變體，被認為會引起構象變化，改善ACE2的結合，增加感染的可能性。
隨著疫情的發展，SARS-CoV-2S-614G變種在頻率上迅速取代親本S-614D變種，成為全球主導。本文章研究者主要想要闡明S-D614G替代在新冠肺炎大流行期間這種SARS-CoV-2變異株的傳播和優勢中所起的作用，研究了S蛋白與人ACE2的結合(HACE2)和體外復制軔力學，並使用三種不同的動物模型評估了體內感染和傳播動力學。
SARS-CoV-2 S-614G可以更有效地與hACE2結合，用生物層幹涉法定量了S1結構域單體與hACE2的結合。含有614D或614G的S1蛋白(分別為S1-614D和S1-614G)都能有效地與hACE2結合；然而，S1-614G的親和力比S1-614D高約2倍(圖1a)，S-D614G替換還導致S1與嬰兒倉鼠腎臟細胞(BHK-hACE2)外源表達的hACE2結合增強(圖1b)。隨後進一步發現SARS-CoV-2S-614G病毒在原代人上皮細胞中的復制增強，研究者使用SARS-CoV-2反向遺傳學系統產生了一個等基因的D614G病毒對。SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G在Vero E6細胞中的復制軔力學略有不同(圖1c)。評估了病毒在原代人鼻上皮(HNE)和原代正常人支氣管上皮(NhBE)在氣液界面條件下的復制軔力學，這種條件類似於人類呼吸道上皮的假復層上皮襯裏。在33 °C鼻腔上皮溫度下，感染SARS-CoV-2S-614D或SARS-CoV-2S-614G後的原代HNE細胞無明顯差異(圖1c)。相反，SARS-CoV-2S-614G在33 °C、37 °C和39 °C（分別模擬上呼吸道、下呼吸道或發燒的溫度）的原代NhBE細胞中顯示出較高的滴度 (圖1D)。競爭試驗的結果表明在兩種原代人類呼吸道培養系統中，614G：614D的比例在感染的5天或8天內向SARS-CoV-2S-614G轉移(圖1e，f)。S蛋白D614G的改變與SARS-CoV-2感染的原代人類氣道上皮模型中hACE2結合增強和復制增加有關。
為了評估SARS-CoV-2S-614G變體在體內的相對適合性，培育了在ACE2基因的內源調控元件下表達hACE2的敲入小鼠。在兩種病毒(SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G)的等量混合的競爭實驗中，透過匯集每個變種的1x105空斑形成單位(PFU)(圖2a)。即時定量PCR檢測口咽拭子(每日)和不同組織(接種P.I後第2天和第4天)的病毒RNA載量。口咽拭子的縱向分析顯示，與野生型小鼠相比，hACE2-Ki小鼠在上呼吸道的病毒復制有效(圖2b)。口咽拭子的NGS顯示，在大多數動物和時間點，SARS-CoV-2S-614G比SARS-CoV-2S-614D具有凈優勢(圖2c)，在器官方面，發現SARS-CoV-2S-614G具有類似的復制優勢(圖2d)。總的來說，這些結果證明SARS-CoV-2S-614G在表達真實人類受體(HACE2)的小鼠模型中復制增加。
研究了S-614變異株在倉鼠模型中的復制軔力學。倉鼠對SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G的感染高度易感，發生的疾病與人類的泛呼吸道、中、重度新冠肺炎病非常相似。以SARS-CoV-2S-614D和SARS-CoV-2S-614G混合毒株1：1(以傳染性PFU滴度為基礎)鼻腔接種6只供體敘利亞倉鼠進行直接「一對一」傳播試驗。隨後使用NGS和帶有等位基因特異性釘選核酸(LNA)探針的數位液滴PCR絕對定量來確認接種體內兩個變異體的RNA比率(圖3)。鼻洗液病毒RNA序列組成的NGS顯示在接種後48小時內顯著向SARS-CoV-2S-614G轉移(圖3)，傳播率為100%，序列組成分析表明，等比例接種後SARS-CoV-2S-614G變異株占比大於90%。
進一步研究了D614G在雪貂中的有利競爭，雪貂的競爭實驗表明（圖4），SARS-CoV-2S-614G變種優先感染和復制了6只接種動物中的5只，傳播事件完全透過SARS-CoV-2S-614G變種成功。
總而言之，研究人員透過開發各種SARS-CoV-2體外和體內感染模型來擴充套件具有D614G取代的S1或單體S胞外結構域的SARS-CoV-2病毒的研究，包括原代NhBE和HNE培養，一種新的hACE2敲入小鼠模型，一種倉鼠模型，以及一種雪貂模型。D614G變異提供的優勢在倉鼠和雪貂的競爭和傳播實驗中變得最為突出，因此必須被視為導致SARS-CoV-2614G變異株在全球占據主導地位的驅動力。
作者介紹
Bin Zhou
博士，本文第一作者，本科畢業於南京大學，博士就讀於紐約州立大學奧巴尼分校病毒學，目前就職於美國疾病預防與控制中心，擔任流感司病毒學監測和診斷處疫苗準備小組組長。
參考文獻
1、Zhou, B., Thi Nhu Thao, T., Hoffmann, D. et al. SARS-CoV-2 spike D614Gchange enhances replication and transmission. Nature (2021).https://
doi.org/10.1038/s41586-
021-03361-1
