近日，考慮到全球替代蛋白、生物多糖原料等必需品的供需緊張，西安交通大學費強教授和團隊 提出了利用嗜甲烷菌轉化甲烷氣體從而合成生物大分子的新範式。
圖 | 費強（來源：費強）
在開發這項新技術的時候，他們發現有兩個關鍵科學技術制約了該項技術的發展：一是菌種的細胞代謝調控機制尚不清晰；二是目標產品的定向合成策略不健全。
針對上述難點，他們圍繞選育天然菌株和改造模式菌株這兩個技術路線，針對嗜甲烷菌細胞工廠，開發了可以高效合成細胞蛋白質和多糖聚合物的高密度發酵技術。
其中，菌體幹重超過 14 克/升，蛋白質時空生產效率接近 20 克/升/天，蛋白質含量超過 70%，生物多糖含量超過 30%，上述生物固碳能力和產品轉化效率等指標均處於國際先進水平。
而隨著本次技術的最佳化和改良，上述生產數據有望在短時間內進一步提高 25%。
在解決生產瓶頸的同時，他們深入解析了細胞工廠中碳氮代謝流的協同適配機制。
透過引入基於氮-氧營養的可控性誘導策略，強化了目標產物的人工定向合成， 顯著提升了蛋白質和生物多糖的生產效率，實作了從一碳分子到生物大分子的一步轉化。
（來源：Green Chemistry）
總的來說， 本次開發的甲烷蛋白制備技術為中國糧食安全和「耕地紅線」的保障提供了切實可行的方案。
費強表示，本次產出的甲烷蛋白粗蛋白質含量超過 70%，富含白胺酸、蘇胺酸、賴胺酸和苯丙胺酸等必需胺基酸，全部 18 種胺基酸占蛋白質比例超過 85%，為單純蛋白質類別。
甲烷蛋白結構比例接近魚粉，遠優於豆粕，可用於平替現有的蛋白飼料。
以工業化生產 1000 萬噸甲烷蛋白（蛋白含量 70%）計，相當於 2300 萬噸進口大豆（蛋白含量 30%）當量。
與種植大豆相比，生產甲烷蛋白能夠節約超過 500 倍的耕地和 3000 倍的淡水資源，不僅無需施用大量化肥和農藥，還不受季節和氣候等因素影響。
此外，透過本次開發的高密度發酵技術，可實作定向聯產胞內多糖和胞外多糖等生物大分子組分。
經檢測，該胞內多糖結構和支鏈澱粉高度相似，具有良好的化石相容性和降解性，可用作醫藥薄膜和水凝膠。胞外多糖則可作為醫美產品的穩定劑、乳化劑和傷口敷料等。
由此可見，利用頁巖氣、煤層氣或沼氣制備生物大分子，不但可以提升甲烷的碳素附加值，還能實作高效的生物儲能和匯碳，為新質生產力發展提供了全新策略。
「向微生物要蛋白」
據介紹，作為第二大溫室氣體，甲烷的 20 年周期溫室效應是二氧化碳的 80 余倍。甲烷氣體來源廣泛，除了人們熟知的天然氣和頁巖氣資源，煤層氣和沼氣也是主要的甲烷氣源。
2015 年，美國憑借先進的頁巖氣開采技術，實作了從天然氣進口國轉變為天然氣純出國口。
中國作為世界頁巖氣已探明儲量第一的國家，2020 年頁巖氣開采量位居世界第二，而隨著國家發展改革委和國家能源局聯合釋出【「十四五」現代能源體系規劃】，預示著中國的頁巖氣產量和開發力度有望實作新的突破。
頁巖氣中甲烷含量超過 95%，而作為低密度、高熱能氣體，頁巖氣的高值開發和高效儲存，也成為中國頁巖氣利用技術發展的焦點。
此外，因為受限沼氣盈利模式差，沼氣工程難以推廣，從而導致農林有機廢碳資源利用不足。
目前，甲烷主要用於燃燒產熱電，利用方式較為單一、附加值較低。而且，甲烷中碳素在燃燒過程中全部轉化為二氧化碳，造成碳排放和碳資源浪費，碳原子經濟性很低。
隨著「雙碳」目標的提出，中國十分重視甲烷的減排及利用技術的開發。一碳生物制造技術在實作甲烷高效固定同時，可以制備多種功能性生物基產品。
嗜甲烷菌是一類特殊的環境微生物，能夠利用甲烷作為唯一碳源生長。因此，甲烷生物轉化技術可在常溫常壓下自發進行，且有毒害副產物和二氧化碳排放較少。
另據悉，豆粕是最重要的養殖業飼用蛋白來源，而中國大豆原料長期大量依賴進口，對外依存度超過 80%，這已成為中國農業的最大短板之一。
在當前日益嚴峻且復雜多變的國際形勢下，大豆供應形勢的不容樂觀，嚴重危及著國家發展和經濟安全。
微生物蛋白的生物制造，已成為解決蛋白資源緊缺的主要途徑之一，而中國相關部門也多次提出「向微生物要蛋白」的需求。
目前，歐盟已經批準微生物蛋白質用於飼料添加劑，美國 Calysta 和丹麥 Unibio 等科技公司也著手研發放大生產技術，並相繼取得了可觀的進展。
但是，全球主流的微生物蛋白核心生產技術和生產菌種仍被歐美國企業所掌握，間接制約了中國的自主技術發展。
菌種：生物制造領域的「芯片」
幾年前，歐美國家的頂尖高校已經在甲烷生物利用方面積累了多年的研究成果和寶貴經驗，而國內研究極少，亟需得到突破。
作為西安交通大學生物化工學術帶頭人，費強長期圍繞生物制造原料的開發與高效利用開展相關前沿科技攻關。
針對甲烷氣體利用方式單一、產品附加值低的問題，2017 年費強帶領課題組成員，開發了以甲烷為原料的一碳生物轉化技術。
考慮到全球人口增長和人們生活水平日益提高，而傳統的動植物蛋白產能已經達到上限，未來將出現蛋白供不應求的局面，因此他們選擇細胞蛋白質作為主要產品之一來開展課題設計。
在確定好課題以後，他們圍繞生物制造的核心要素（微生物菌種和高密度發酵技術）開展研發。
菌種是生物制造領域的「芯片」，其很大程度上決定了產能和產品質素，而中國在工業菌株研發和保藏方面實力較弱，仍處於追趕國外先進水平的階段。
沒有自主知識產權的菌種，很難形成核心競爭力，日後容易在關鍵時刻被「卡脖子」。
2017 年在陜西省重點研發計劃專案的支持下，費強多次帶領課題組成員前往陜西各類濕地環境收集樣本。
在經過上百次的菌種選育和鑒定，最終在秦嶺山下水稻田和牛背梁等地樣品中獲得了十余株嗜甲烷菌種。
其具有生長速率快、抗逆性強等優勢性狀，並能夠天然合成優良蛋白質、活性多糖、天然產物等高附加值產品，其中部份產品的生產方法獲得國家專利發明並完成了成果轉化。
2019 年，費強作為專案骨幹，得到了國家重點研發計劃「合成生物學」重點專項支持，借助生物合成等前沿技術深入挖掘了微生物體內的關鍵功能基因和代謝調控機制，完善了遺傳改造工具和人工細胞構建方法。
透過對關鍵機制機理的全面探究和解析，他們成功建立了一整套以嗜甲烷菌細胞工廠為中心的甲烷生物制造平台技術，實作了利用基因工程菌生物合成包括精細化學品、生物材料、藥物中間體等高值產品。
在長期的累積後，2021 年費強作為專案負責人和首席科學家獲得了國家重點研發計劃「綠色生物制造」重點專項的支持。
團隊成員透過完成數千批搖瓶實驗，從頭搭建了多種培養體系，驗證了氣源組分、培養基成分及濃度對菌種的影響，實作了甲烷和沼氣的高效生物轉化利用。
在過去的 3 年中，課題組歷經了上百批次的發酵實驗，成功開發了針對嗜甲烷菌的高密度發酵工藝和策略。
期間，他們完成了從 0.3L 到 30L 的生物反應系統攻堅，實作了實驗室級別的 100 倍放大，最終建立了針對不同目標產物的嗜甲烷菌高密度發酵工藝。
值得一提的是，雖然他們在本次論文中提及的發酵工作所占篇幅很少，但背後隱藏著幾十批「不理想」的發酵實驗引導他們總結經驗。
最終，他們不僅獲得了最優工藝，還系統性總結了嗜甲烷菌蛋白和多糖的合成機制，首次提出了基於營養調控策略誘導生物大分子合成的新策略。
2023 年，他們又與大型沼氣生產平台合作，探索了 100L 生物反應系統的連續高密度發酵工藝，初步驗證了該工藝放大的可靠性，為實作甲烷蛋白的產業化生產奠定了堅實的基礎。
努力確保甲烷生物制造全套工藝和器材的自主產權
事實上，在菌株篩選和工藝最佳化期間，他們遇到了很多困難，課題一度停滯不前，學生們的信心和積極性多次大幅受挫，大家的心態也經常波折起伏。
由於缺乏適配氣體碳源的高通量選育系統，嗜甲烷菌篩選過程耗時費力，時常需要準備大量的消耗品。
自然環境中嗜甲烷菌常與其他微生物協同生長，彼此之間存在較強的互作依賴關系，分離獲得單株嗜甲烷菌極為困難。
費強印象最深的是，有一名碩士研究生歷時一年好不容易篩選到了可能富含類胡蘿蔔素的嗜甲烷菌，但可能因為保藏時染菌，經過二十輪篩分還是沒能獲得單一菌株，最後只得被迫放棄純化，轉而以混菌體系進行研究。
不僅如此，嗜甲烷菌的發酵工藝最佳化也是一波三折。甲烷是氣態碳源，且溶解度極低，氣液傳質速率是嗜甲烷菌生長的主要限制因素。
發酵罐體系與搖瓶體系的氣液傳質速率相差太大，導致他們在搖瓶體系摸索發酵條件時困難重重，而且效率低下。
一開始，他們沿用大腸桿菌等模式菌株發酵最佳化研究，主要對培養基組分濃度、溫度和酸堿度等條件進行單因素和響應面最佳化，但收效甚微。一名博士研究生在接手該部份工作後，曾有近一年半未取得任何實質性進展。
另一方面，費強認為正是嗜甲烷菌研究特有的挑戰性，驅動他們團隊不斷創新和堅持做原創性研究。
本次研究中，他們遇到的一些問題很難在其他微生物的相關研究中找到參考解決方案。這倒逼他們追根溯源，深入挖掘嗜甲烷菌獨特的代謝調控機制。
最典型的案例是，在模式菌株中常用的分批補料發酵不僅未能提高嗜甲烷菌細胞密度，反而導致蛋白產率下降。
起初他們百思不得其解，借助轉錄組學手段他們發現該工藝後期細胞處於營養失衡狀態而生長停滯，碳流被用於合成胞外多糖。
這一發現使他們轉向開發連續發酵工藝提高蛋白生產效率，並引導他們開始思考是否可能存在某種未知機制，從而控制嗜甲烷菌合成蛋白和多糖。
最終，相關論文以【嗜甲烷菌生物合成可食用產品的可控性誘導新策略】（A novel nutritional induction strategy flexibly switching the biosynthesis of food-like products from methane by a methanotrophic bacterium）為題發在 Green Chemistry [1]。
博士研究生高子熹是第一作者，費強教授擔任第一單位通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：Green Chemistry）
由於這項開創性工作對於替代蛋白和生物多糖功能的開發具有重大意義。鑒於此，本次論文也被 Green Chemistry 邀請作為封頁論文發表。
但是，課題組希望不僅僅是發展一個「實驗室技術」，而且非常關註技術的產業化落地，希望這個技術能夠真正發揮其價值。
目前，他們已經與有著豐富發酵工程化經驗的公司展開合作，推進技術的工程化放大。
同時，也與頁巖氣資源豐富的地方政府和產業上下遊企業開展了卓有成效的工作，為產業化儲備了豐富的資源。
而作為中國首個以甲烷為原料開發嗜甲烷菌生物制造技術的科研團隊，後續他們將繼續圍繞嗜甲烷菌的物質代謝和能量代謝進行精準耦合調控。
透過強化細胞內碳-氮代謝的互作關系，實作特定胺基酸的定向合成，從分子水平上提升甲烷生物轉化效率和目標產品的生產效率。
鑒於生物合成多糖在食品、醫療、環境、材料等領域具有廣泛的市場空間，他們也將針對甲烷多糖在醫美原料和農用菌肥方面的套用，進一步開展理化和生物活性的功效實驗。
為了適應工業化生產，他們將首先聚焦開發具有較高氣液傳質速率的新型生物反應系統，以適配利用不同甲烷氣源進行嗜甲烷菌高密度發酵和目標產品生產工藝，為確保甲烷生物制造全套生產工藝和器材具有自主知識產權。
不久之後，他們將根據不同甲烷氣源進行全工業條件下的連續化中試生產驗證，選址包括頁巖氣基地、畜禽養殖場和天然氣尾礦等，從而展現甲烷蛋白或多糖的規模化生產及其碳減排潛力。
參考資料：
1.Gao, Z., Guo, S., Chen, Y., Chen, H., Fu, R., Song, Q., ... & Fei, Q. (2024). A novel nutritional induction strategy flexibly switching biosynthesis of food-like products from methane by a methanotrophic bacterium. Green Chemistry.
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