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以下为博溪检测类器官与评价科学研究院陆星博士的报告实录：
各位领导、各位来宾，大家下午好。今天我将与大家分享【微流控细胞与器官芯片在美白祛斑功效方向的测评应用】，以美白祛斑功效为例向大家介绍芯片具体的测评应用。
从古至今，美与白是我们不变的追求。随着朝代更迭，从追求肤若凝脂，到面如白玉，再到人面桃花，人们对白的追求与审美不仅仅停留在表观，更是由内而外的健康白。美白的方式也实现了从外遮到内调，从刺激到安全的进阶。如今，我们已能从更加科学的角度、更加高效的方式来认识美白、研究美白。
PART 01 皮肤的美白机制是复杂的，我们需要关注更集成的通路
那究竟是什么决定了人的肤色呢？皮肤从结构上分为表皮层和真皮层，而影响肤色的黑素细胞位于表皮的基底处。黑素小体是黑素细胞内独特的细胞器，负责黑色素的生物合成、储存和运输。有研究表明，世界上三大主要人种中，黑种人皮肤中黑素小体占比高达89%，白种人仅有15%。高度色沉的皮肤比浅度色沉的皮肤中的黑素小体高出5倍，这也是导致不同人种肤色不同的主要原因。另外，我们的皮肤在经过太阳光暴晒后，黑素细胞会分泌更多黑素小体及黑色素，使表观皮肤呈现不同颜色。因此， 黑素细胞及黑素小体的合成效率决定了不同种族以及不同状态的肤色差异。
再具体来说，在黑素细胞内，酪氨酸经过酪氨酸酶的催化、氧化等一系列步骤，最终会合成真黑素和褐黑素，其中真黑素与皮肤色沉直接相关。每一个黑素细胞周围，大约有36个角质形成细胞，黑素细胞通过树突向角质形成细胞输送黑素小体，黑素小体会在角质形成细胞核上形成核上帽，对角质形成细胞提供光保护。 所以，黑素小体及黑色素在表皮层中的分布和含量决定了不同肤色。
现阶段我们常用的美白祛斑功效验证方法主要有以下五种，涵盖了蛋白和分子层面：酪氨酸酶的活性检测（包括与黑素合成相关基因的检测）、黑素含量检测、黑素细胞银染、黑素合成相关蛋白检测、以及包含角质形成细胞的黑素转运能力检测。
黑素合成、转运、分布机制是复杂的，因此我们可以找到很多方法抑制黑素合成，达到美白功效。比如，从源头抑制黑素合成、在过程中抑制黑素转运、甚至从结果上促进黑素代谢与自噬。但是， 在目前的检测方法中，80%都集中在抑制黑素细胞内的酪氨酸酶活性，忽略了同样有重要影响的黑素转运和代谢过程。
PART 02 现有方法难以实现美白活性物的筛选，原料创新陷入瓶颈
现阶段，对比紧致功效方向的原料，行业内美白原料类别偏少——在注册备案并广泛使用的原料中，烟酰胺和间苯二酚占据了较高比例。将现有的美白原料进行多靶点、多机制的组合以达到1+1>2的协同增效作用，是现在美白产品常用手段之一。
反观消费者对美白产品的需求，越来越趋于场景化，常见的诸如日照、炎症、衰老等。使用光敏性原料的化妆品、摄入光毒性药物，也会导致皮肤色素的沉着。复杂的场景下，加上消费者意识的提升，不同肤质的消费者对美白产品的开发提出了更为精细化的要求。
PART 03 精准美白需要对不同场景下的色沉及美白机制进行更深入的研究
光照是常见的皮肤色沉场景，像紫外、蓝光，诱导色沉的机制都是不同的。 紫外光主要会使细胞内DNA受到氧化应激损伤，从而激活下游基因，诱导黑素合成相关蛋白的高表达。可见光（如手机、电脑发出的蓝光）主要通过视蛋白3介导引起下游蛋白依次磷酸化，导致黑素合成上调。光照条件下，角质形成细胞和成纤维细胞也会分泌不同的细胞因子来调节黑素细胞功能，促进或者减少细胞氧化应激损伤，来调节黑素合成。
过度光老化会导致细胞衰老，这又是另一个会导致色素沉着的常见场景， 如老年斑、黄褐斑的形成。细胞老化导致的色素沉着不仅仅局限于黑素细胞，还会和其临近的皮肤细胞相互作用，如角质形成细胞、成纤维细胞及内皮细胞的衰老，共同参与皮肤色素陈追稳态的调节。同时，衰老细胞会分泌多种炎症因子、生长因子、蛋白酶等（衰老细胞分泌表型，SASP），诱导靶细胞衰老及组织微环境改变，进一步导致皮肤色沉。
另外，有研究表明，免疫细胞的衰老也会参与皮肤色沉， 导致炎症色沉。炎症色沉是指皮肤在受到刺激或炎症后出现的皮肤色沉现象。当表皮受到炎症刺激，角质形成细胞会分泌促炎因子，刺激黑素细胞生成更多黑色素，或通过旁分泌的反馈路径，刺激真皮层成纤维细胞释放黑素细胞刺激因子，从而调节黑素合成。
其实， 皮肤色素沉着不仅仅与黑素细胞有关，还与角质形成细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞等多种细胞的作用密不可分。而成纤维细胞、黑素细胞及角质形成细胞形成的FMK互作体系，在色素沉着中发挥至关重要的作用 。
PART 04 针对复杂美白机制的模型应满足高通量、高重复性、更高效、更准确的设计要求
我们结合微流控细胞芯片，以黑素细胞为核心，加入成纤维细胞、角质形成层细胞，用3D培养、流体力学方法共培养，构建新型美白测评功效模型。该模型有两个特点：
特性一：支持更复杂细胞构成类器官模型，可构建单一黑素细胞模型或三种及以上黑素细胞全层皮肤类器官模型。 通过细胞的染色定位，可以观察到在自组装情况下类器官显示出一定极性，结构与真实皮肤类似，成纤维细胞居于外侧，角质形成层细胞居于内侧，黑素细胞均匀分散。
特性二：相对于微孔板体系，展现出更强的细胞自组装能力。 在微孔板中，黑素细胞沉落到底部过程中很容易聚团，很难与其他细胞均匀接触，自组装成类器官。而微流控芯片由于独特的结构设计，黑素细胞可以迅速沉落到坑底，与其他细胞接触互作，均匀分布，形成自组装类器官。
基于以上特性，我们建立了美白祛斑功效的测评体系。 首先向芯片内灌注一定浓度和比例的细胞，使其自组装成类器官，然后加入不同浓度的待测化合物，进行孵育，即可在镜下拍照、染色、检测等相关测试。
利用该模型，我们也进行了多种美白原料的功效测试。图中展示了明场环境的照片，可以看到从Day1到Day3，黑素全层皮肤类器官模型表观色度逐渐变黑，表明黑素细胞的正常合成及转运分布。我们选取了四种常见的美白原料，分别为曲酸、光甘草定、熊果苷和烟酰胺。在成纤维细胞、黑素细胞和角质形成细胞相互作用的体系下，这四种美白原料均展现出了较好的美白效果。
局部放大芯片，还可以更为细致地观察黑素全层皮肤类器官细胞球色度及直径、黑色素分布情况。
另外，我们针对黑素全层皮肤类器官开发了一套算法。基于这些算法，我们对化妆品原料进行了实时分析，每组至少选择了24个细胞球，可以看到这四种化合物都能显著降低细胞球色度。
与传统方法相比，黑素全层皮肤类器官芯片能够更加真实反映化合物的功效 。烟酰胺在人体上展现出非常好的美白效果，一方面是它可以通过抑制黑素小体从黑素细胞转运到角质形成细胞，另一方面它能够抑制黑素的合成，并具有一定的抗氧化和抗炎作用。但是在单一的黑素细胞及黑素细胞与角质形成细胞共培养体系中，并未发现烟酰胺有很好的效果，而黑素全层皮肤类器官在三种细胞相互作用及流体力学支持下，能很好地模拟真实微生理环境，从而使烟酰胺展现出更接近在人体上真实使用时的功效。
除了表观色度，
我们还进一步分析了细胞球内特异性蛋白的表达
。gp100是黑素小体中的特异性蛋白。通过免疫荧光染色，我们观察到四种化合物都使其表达含量下降，说明它们均可抑制黑素小体的生成。
黑素全层皮肤类器官芯片包含三种细胞，因此，我们还可以进行两种或两种以上蛋白质的复染，来研究黑素转运的机制。我们复染了gp100蛋白及角质形成细胞内泛角蛋白，可以看到烟酰胺不仅可以降低黑素小体合成，还能抑制其向角质形成细胞转运。 微流控皮肤类器官芯片可在原位快速实现多蛋白的表达分析 ，1~2天即可完成实验。
目前，黑色素定量分析公认的方法是将细胞裂解，再提取黑色素检测吸光度。相比这种破坏性测试方法，我们开发了非侵入性的方法——拉曼光谱，来进行黑色素的量化分析。以烟酰胺样品进行了拉曼光谱检测，我们可以得到三个坐标轴信号强度的变化（红色代表信号强度高，即黑色素含量高；蓝色代表信号强度低，即黑色素含量低），图中可看到烟酰胺能够明显降低细胞球内黑色素含量。
此外，我们还进行了主成分分析，可得到烟酰胺处理组和空白对照组有明显差异，说明烟酰胺不仅降低了黑色素的含量，还可能改变了细胞内的其他成分。
拉曼图谱不仅可以识别黑色素含量变化，还可以检测蛋白质、脂质等多个成分指标。
以上都是我们对多样品的功效测试，而 皮肤类器官芯片还可以结合浓度梯度发生器芯片进行单个样品的多浓度功效测试 。我们也以烟酰胺为例进行了不同浓度的测试，从结果上看，不同浓度烟酰胺有不同程度的美白效果，高浓度时展现出很好的美白效果。
相比于传统先进行细胞毒性检测筛选出安全浓度，再进行功效检测，使用 皮肤类器官芯片加浓度梯度发生器芯片，可以实现样品安全性及功效性的同步快速筛查，还可以进行多样品原料的快速复配，实现种类、比例、浓度的筛选 。图中也可以看到最高浓度的烟酰胺对细胞球产生了一定毒性，使其略微分散。
通过以上的案例，我们可以看到皮肤类器官芯片具有诸多优势，
如更少的细胞使用量及更快的细胞成球时间、更好的细胞均一程度等
。流体力学的加持，不仅支持全换液模式，还增强了药物敏感性。黑素全层皮肤类器官模型，相比于传统的2D细胞和3D重组皮肤类器官模型，
能够在多种细胞互作的情况下更加高效、准确地对美白原料进行功效测试，不仅适用于活性物或活性物复配的盲筛，也可以灵活改变组成细胞种类、添加不同细胞因子及趋化因子，未来还可增加力学机械条件，以模拟和适配更多场景。
PART 05 微流控类器官芯片未来在美白祛斑功效研究方面的作用
微流控类器官芯片构建的皮肤类器官模型实现了多项突破， 能够更加真实地模拟人体生理结构，实现更高效、更精确的美白祛斑成分测试，提高美白产品的研发效率和安全性，推动个性化美白产品的开发，加快新产品上市速度 。下一步，我们将继续探索更加多样化的类器官模型构建，以适配更加细分的场景。同时，通过 超分辨显微镜进行类器官自组装过程及细胞定位变化的时空监测，也能动态监测药物作用过程中黑素变化过程 。
相信随着技术的不断推进以及场景的不断拓展中，微流控类器官芯片在美白祛斑功效上能够发挥越来越重要的作用。
感谢大家！
