qRT-PCR（即時熒光定量PCR）是RNAi的標準檢測方法，今天小優就以一個siRNA沈默mRNA的案例來展示如何進行計算吧~
RNAi實驗的步驟
本案例采用即時一步RT-PCR分析CDC2基因剔除情況。流程如下：
步驟1： siRNA轉染 - HeLa S3細胞轉染靶向人類CDC2基因的0.5 nM siRNA、陰性siRNA對照（與任何已知的哺乳動物基因沒有同源性的非沈默對照siRNA）。並添加未轉染細胞作為對照。
步驟2： RNA純化 ——48小時孵育後，收集細胞，使用試劑盒純化RNA。
步驟3：使用以上RNA為樣版進行qRT-PCR。使用一步法q RT-PCR試劑盒，（逆轉錄反應和擴增在同一試管中進行）。進行CDC2和GAPDH（一種管家內源性參考基因）的基因特異性定量。
qRT-PCR還需要註意以下內容：
（1）無樣版對照NTC：這是一個無樣版RNA，可用ddpO補足，包含擴增反應的所有成分。NTC可以檢測到qRT-PCR反應組分中可能存在的任何汙染。
（2）內源性內參基因的標準化：內源內參基因是指表達水平在樣本之間不存在差異的基因。將目的基因與內源性內參基因進行比較，可糾正RNA含量的變化和樣本處理中的其他差異。在本實驗中，使用管家基因GAPDH進行歸一化。
（3）來自未轉染細胞的樣版：對未轉染對照的分析顯示，在沒有任何處理的情況下，基因表現水平。
（4）來自陰性siRNA對照的樣版：將轉染陰性siRNA對照的細胞中的靶基因表現與轉染基因特異性siRNA後的基因表現進行比較，計算基因剔除率。
未轉染對照組的基因表現水平應與轉染陰性siRNA對照組觀察到的水平進行比較。二者基因表現應該是相似。這兩個樣本之間的任何基因表現差異都是由非特異性效應引起的。
（5）每個樣本至少重復2次。重復實驗對於解釋樣本間的變化很重要，以確保數據是可靠和穩健的。至少應進行2次重復實驗，重復之間的差異應較低。為了確保變異是可接受的低水平，計算變異系數（%Cv=（標準偏差（重復）/平均CT（重復））x100）。這一點應該始終低於3%。
步驟4：結果分析：獲取到可信的CT值，進行計算。本實驗數據如下：
使用∆∆CT方法計算siRNA沈默效率，計算公式如下：
靶基因表現=2-∆∆CT
∆CT (樣本) = CT 靶基因– CT內參基因
∆CT (對照) = CT 靶基因 – CT內參基因
∆∆CT = ∆CT (樣本) – ∆CT (對照)
本實驗數據帶入公式計算： ∆CT(樣本) = 26.22 – 15.49 = 10.73
∆CT (對照) = 22.79 – 15.28 = 7.51
∆∆CT= 10.73 – 7.51 = 3.22
樣本中靶基因表現= 2-3.22 = 0.107，CDC2 siRNA對樣本的沈默效率為：100%-10.7% = 89.3%。
一般來說，下調70%或以上被認為是顯著高的。然而，根據細胞類別、靶基因和下遊檢測的不同，較低的敲低水平可能也就足以用於RNAi研究。
其他的基因調控實驗，如miRNA mimic，cDNA等均可以使用同樣的方法進行計算。
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